Auszug aus "Bestimmung von Vitamin A und E in kosmetischen Mitteln", SÖFW-Journal, 120. Jahrg. 8/94, S44-449 mit freundlicher Erlaubnis der Autoren und des Verlages für Chemische Industrie, Augsburg.
Summary
A simple routine method was developed for the determination of vitamin E. After extraction
with isopropanol quantitative and qualitative determinations of the extracted vitamin
components were carried out by HPLC using RP-18 with fluorescence. Using this method different
cosmetic products on the market were determined on their vitamin content. It could be shown that,
based on the determined contents, an advertisement of vitamins is not justified in a large majority
of products.
Einleitung
Die bisher bekannten gängigen Verfahren für Lebensmittel sind infolge der
störenden Begleitstoffe zeitaufwendig und arbeitsintensiv [1-5]. Aufgrund des Prinzips dieser
Verfahren (Verseifung/Extraktion) begrenzt sich die Analytik auf die Bestimmung der Vitaminmenge
über die freigesetzten Alkoholverbindungen. Die Erfassung der Ester, die wegen ihrer größeren
chemischen Stabilität überwiegend eingesetzt werden, ist bei diesen Methoden nicht möglich.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird zusammenfassend ein Aufarbeitungsverfahren
vorgestellt, welches erlaubt, in kosmetischen Mitteln zugesetzte Vitamin-E-Verbindungen (d.h. auch
Ester) routinemäßig zu isolieren. Die sich anschließende Identifizierung und Quantifizierung
erfolgt unter Anwendung der Hochdrucklüssigkeitschromatographie [2, 6-8].
In den folgenden Ausführungen werden die Ergebnisse der konventionellen
Aufarbeitungsmethode (Verseifung und Extraktion) den Ergebnissen der neu entwickelten
Aufarbeitungsmethode (Extraktion im Zentrifugenglas) gegenübergestellt.
Material und Methoden
1.Untersuchungsmaterial
Vitaminisierte kosmetische Zubereitungen des Handels
2.Chemikalien
Referenzsubstanzen: alpha-, beta-, gamma, delta-Tocopherolisomere (Art 15496 Merck,
Darmstadt), d,l-alpha-Tocopherolacetat (Art 8284 Merck, Darmstadt)
Lösungsmittel: 2-Propanol (Art. 6752 Roth, Karlsruhe), Isooctan (Art. 4718 Merck,
Darmstadt), tert.-Butylmethylether (Art. 1842 Merck, Darmstadt) Ethanol (Art. 32205 Riedel-de
Häen, Seelze), bidest. Wasser; Methanol (Art. 6007 Merck, Darmstadt), Petrolether (Art. 915
Merck, Darmstadt)
Feststoffe: Kaliumhydroxyd (Art. 5033 Merck, Darmstadt), Hydrochinon (Art. 822333
Merck, Darmstadt), Titriplex III (Art. 8418 Merck, Darmstadt), Natriumsulfat sicc. (Art. 6649
Merck, Darmstadt)
Standardlösungen: a) je 50 mg der Tocopherolisomere in 100 ml 2-Propanol lösen, davon 2/50/20/25 ml verdünnen; b) 50 mg Tocopherolcetat in 50 ml 2-Propanol davon 20 auf 25 ml verdünnen (Stammlösungen: photometrische Gehaltsüberprüfung [9]). Standard- und Probelösung sind bis zur Injektion vor Licht und Wärme zu schützen und unter Stickstoff aufzubewahren.
3. Geräte und Hilfsmittel
Glasstäbe, Pipetten, 20- und 25-ml-Meß-kolben (Braunglas), Rotationsverdampfer, 500- und 250 - ml Rundkolben (Braunglas), Hamil- tonspritze ny-l, Faltenfilter 595 1/2 (Schleicher & Schuell), Rückflußkühler, 100 ml Bechergläser, 50 ml Zentrifugengläser mit Schliff und Stopfen, Schütteltrichter, Erlenmeyerkolben, Analysenwaage (Sartorius 2006 MP), Magnetrührer, UV/VIS Spektralphoto-meter 550 SE (Perkin-Elmer), Zentrifuge (Sigma 3K 30), Ultraschallbad.
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) System Gold (Beckman): Analytische
HPLC-Pumpe Typ 126; Injektion: Probendosierventil Beckman, Detektor: Beckman,
Detektor: Shimadzu RF-535 Fluoreszenzdetektor, Drucker: Epson FX 8000.
4. HPLC-Bedingungen (Bestimmung von Vitamin E)
Trennsäule 1: LiChroCart Merck Liochrospher 100 RP18 endcapped (5 ny-m) 250x4 mm
und Vorsäule 4x4 mm (Merck, Darmstadt), Fließmittel: Methanol; Flußgradient: 0-5 min: 1ml/min in 3 min auf 4 ml/ min, 8-15 min: 4 ml/min in 3 min auf 1 ml/min.
(Retentionszeiten in Klammer): gamma- und beta-Tocopherol (8.0 min), alpha-Tocopherol (8.3 min), alpha-Tocopherolacetat (9.2 min).
Trennsäule 2: LiChroCart Merck Lichrospher Si-60 (5 my-m) 250x4 mm mit Vorsäule 4x4 mm (Merck, Darmstadt), Fließmittel: Isooktan/tert.-Butylmethylether (95:5) Fluß: 3 ml/min [7,8]. (Retentionszeiten in Klammer): alpha-Tocopherolacetat (2.5 min); alpha-Tocopherol (5.l min), ß-Tocopherol (8.2 min), gamma-Tocopherol (9.8 min), delta-Tocopherol (14.1 min). Die Tocopherolisomeren ß- und gamma-Tocopherol werden nur auf dieser Säule getrennt.
Fluoreszenzmessung: Extinktion: 295 nm, Emission: 330 nm (Vitamin E),
Auswertungssystem: Chromatographische Workstation bestehend aus Computer und HPLC-Software System Gold (Beckman)
5. Aufarbeitung und Bestimmung von Vitamin E
a) Aufarbeitung:
Methode 1 (nach Mankel [1]) (konventionelle Aufarbeitungsmethode)
Verseifung: 1-2 g Untersuchungsmaterial (0,1-0,5 mg Vitamin E) werden mit 100 ml
Ethanol verrührt, mit je 1 Spatelspitze Hydrochinon und Titriplex sowie einer Lösung aus ca. 3
g Kaliumhydroxid in 10 ml dest. Wasser versetzt und unter Rühren anschließend 30 Minuten
unter Rückflußkühlung und Stickstoffein-
leitung hydrolysiert.
b) Extraktion:
Nach dem Abkühlen des Kolbeninhaltes wird in einem 500-ml-Scheidetrichter dreimal mit
ca. 100 ml Petrolether extrahiert. Mögliche Emulsionen können mit wenigen Tropfen Ethanol
zerstört werden. Nach Überführen der gesammelten Extrakte in einen weiteren
Scheidetrichter, diese mit Wasser alkalifrei waschen und mit Natriumsulfat trocknen. Das Lösungsmittel
am Rotationsverdampfer bis auf 1 ml einengen, Rest mit Stickstoff abdampfen. Der Rückstand
wird je nach Trennsäule in Isooktan oder Isopropanol auf ein definertes Volumen aufgefüllt und
injiziert
Methode 2 (neu entwickelte Aufarbeitungsmethode)
Proben: 0,5-2 g (0,1-0,5 mg Vitamin E) der Probe in einem mit Alufolie
umwickelten Zentrifugenglas (50 ml mit Stopfen) mit Natriumsulfat sicc. bis zur pulvrigen Konsistenz
verrühren. Nach Zufügen von genau 25 ml 2-Propanol (ggf. nur von 20 ml) wird erneut verrührt.
Anschließend 2 Minuten kräftig schütteln, mit Stickstoff durchblasen und nach dem Absetzen
(30 min) des Natriumsulfats zentrifugieren ggf. filtrieren (Faltenfilter 595 1/2). Die klare
organische Phase wird injiziert.
Methode 3 (erprobt für Hautöle)
Proben: 0,5-2 g (0,1-0,5 mg Vitamin E) werden in 25 ml Isooktan gelöst und injiziert.
c) Bestimmung:
Aufarbeitung nach Methode 1: Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Trennsäule
1, Fluoreszenzdetektion, (HPLC-Bedingungen vgl. Material und Methoden Nr. 4)
Aufarbeitung nach Methode 2: Hochdruckflüssigkeitschromatographie,
Trennsäule 1, Fluoreszenzdetektion (HPLC-Bedingungen vgl. Material und Methoden Nr. 4)
Aufarbeitung nach Methode 3: Hochdruckflüssigkeitschromatographie,
Trennsäule 2, HPLC-Parameter vgl. [7,8]
Chromatogramm 1 Rt: 2.5 min alpha-Tocopherolacetat, 5.1 min alpha-Tocopherol; 8.2 min
ß-Tocopherol, 9.8 min gamma-Tocopherol, 14.1 delta-Tocopherol (Ex. 295 nm; Em. 330 nm)
Ergebnisse und Diskussion
Zusammenfassend erwies sich somit das erprobte einfache Extraktionsverfahren zur
quantitativen Isolierung der Vitamin E-Verbindungen in kosmetischen Mitteln als reproduzierbar und
für die Routineanalytik einsetzbar. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden weitere kosmetische
Produkte wie z.B. Sonnenprodukte auf ihre Vitamin-E-Gehalte untersucht. Hierbei zeigte sich, daß
die einfache Extraktion im Zentrifugenglas mit Isopropanol (Methode 2) bei den meisten der
hier untersuchten Produkte angewandt werden konnte. Bei einigen wenigen Sonnenmitteln (2 von
43 untersuchten Proben) war diese Methode aufgrund störender Matrixbestandteile bei der
Chromatographie an RP-18-Säule ungeeignet. Für vitaminisierte Hautöle erwies sich die bereits
an nativen Ölen zur Tocopheroldifferenzierung erprobte einfache Aufnahme in Isooktan
(Methode 3) als vorteilhafter, was jedoch die Extraktion mit Isopropanol nicht ausschließt.
Zusammenfassung
Zur Bestimmung von Vitamin E sowie derer Derivate in kosmetischen Zubereitungen wird
ein einfaches Probenaufarbeitungsverfahren für die Routineanalytik vorgestellt. Nach
extraktiver Abtrennung mit Isopropanol erfolgt die Identifizierung und Quantifizierung mittels HPLC an
RP-18-Phase unter Anwendung der Fluoreszenzdetektion. Anhand dieser
Bestimmungsverfahren wurden verschiedene kosmetische Zubereitungen des Handels auf ihren Vitamingehalt
untersucht. Es zeigte sich, daß bei den meisten der untersuchten Produkte, die Auslobung der
Vitamine aufgrund der ermittelten Gehalte derzeit in Frage gestellt werden muß.
Literatur:
[1] Mankel, A.; Dtsch. Lebensmittel. Rdsch. 75, S. 77 - 85 (1979)
[2] Bognar, A.; Z. Lebensm. Unters. Forsch. 182, S. 292-297(1986)
[3] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG Hrsg. u. Red.
Bundesgesundheitsamt, Beuth Verlag GmbH, Berlin-Köln
4] Bourgeois, C.F.and Ciba, N.; J.Assoc. Off ANal. Chem. 71, S. 12 - 15 (1988)
[5] Kim, Y., English, D. Reich, P., Gerber L. E. and Simpson, K. L.; J. Agric. Food Chem. 38, S. 1930 - 1933 (1990)
[6] Kountounellis J. E. et al.; Pharmazie 40, S. 193 ff
[7] Shell, U.; Fresenius Z Anal. Chem. 318, S. 287 - 288 (1984)
[8] Gertz, C.; Herrmann K.; Lebensm. u. gerichtl. Chemie 36, S. 53 - 58 (1982)
[9] Deutsches Arzneibuch DAB 10, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart (1991)
10] Hoffmann-La Roche; Vitaminkompendium (1989)
[11] Kreuznacher Symposium: Hautpflege, Produkte-Wirkung-Prü fung" 1988
[12] Kästner, W.; Fat. Sci. Technol. 91, Nr.6 (1989)
[l3] Vitamin E Research and Information Service; Veris 2, Nr. 4 (1992)
